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质粒DNA的提取与鉴定

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-9-4  点击次数:1382

[实验目的]

通过本实验,学习和掌握碱裂解法提取质粒。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时,共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[实验仪器与设备]

1.恒温培养箱 2.恒温摇床

3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机

5.高压灭菌锅 6.超净工作台

7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip

[实验材料]

1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)

3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾

7.冰乙酸 8.氯仿

9.乙醇 10.胰RNA酶

11.氨苄青霉素 12.蔗糖

13.溴酚蓝 14.酚

15.β巯基乙醇 16.盐酸

17.含pUC18质粒的大肠杆菌

 

附:试剂的配制

1.溶液Ⅰ

50mmol/L 葡萄糖

5mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)

10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)

2.溶液Ⅱ

0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合

3.溶液Ⅲ

5mmol/L 乙酸钾 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

4.TE缓冲液

10mmol/L Tris·HCl

1 mmol/L EDTA(pH8.0)

5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)

6.胰RNA酶

将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。

7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚

8.酚

[实验步骤]

(一) 提取质粒

1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中,接入含质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。

2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中,4000rpm,离心2min。

3.吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。

4.将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中,充分混匀,室温放置10 min。

5.加200μl溶液Ⅱ(新鲜配制),混匀内容物,将离心管放冰上5 min。

6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀。

7.1200rpm,离心15 min,将上清转至另一离心管中。

8.向上清中加入等体积酚:氯仿(去蛋白),反复混匀,12000rpm,离心5min,将上清转移到另一离心管中.

9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。

10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。

11.加50μl TE缓冲液,其中含有20μg/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解,-20℃保存。

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