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核酸分离与纯化的设计与原则

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-9-12  点击次数:1306

细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子,均与蛋白质结合成核蛋白(nucleoprotein)。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(deoxyribonucleoprotein,DNP),RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内,约占95%,为双链线性分子;后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内,约占5%,为双链环状分子。除此之外,在原核生物中还有双链环状的质粒DNA;在非细胞型的病毒颗粒内,DNA的存在形式多种多样,有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大,一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3.0×109个碱基对(base pair, bp)组成,与5?243bp的猿猴病毒(simian virus 40, SV40)相比,其长度约为后者的5.7×105倍。相对来讲,RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的,RNA的种类、大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。
 

材料与方法的选择
 
(一)材料与方法的选择
临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等;核酸分离与纯化的方法非常多,如何恰当地收集与准备材料,选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的,不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求;至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑;在不影响核酸质量的情况下,应选择安全无毒的试剂与方案。近年来,有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用,能批量制备核酸样品,大大提高了分离与纯化的效率。
(二)选择的原则
核酸分离与纯化的方法很多,应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法,都应遵循总的原则:一是保证核酸一级结构的完整性,因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求;二是尽量排除其它分子的污染,保证核酸样品的纯度,这是本章讨论的主要内容。
(三)核酸完整性的保持
为了保证核酸的完整性,在操作过程中,首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多,包括物理、化学与生物学的因素,其中有些是可以避免的。如过酸或过碱,对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用,在核酸的提取过程中,采用适宜的缓冲液,始终控制pH在4~10之间,就可以很好地避免其危害;另外如高温加热,除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外,还可能因煮沸带来液体剪切力,因此核酸提取常常在0~4℃的条件下进行。
其次对无法避免的有害因素,应采取多种措施,尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤,缩短提取的时间,减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏; DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子,若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作,基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点,决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。

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