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DNA的粗提取与鉴定

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-9-13  点击次数:1291

[目的要求]

学会DNA的粗提取和鉴定的方法,观察提取出来的DNA物质。

[实验原理]

DNA在氯化钠溶液中的溶解度,是随着氯化钠的浓度变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。

DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此,二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

[实验仪器与设备]

1. 铁架台 2. 玻璃棒(1个)

3. 滤纸 4. 量筒(100ml,1个)

5. 烧杯(100ml 1个, 50ml和500ml各2个 ) 6. 试管(20ml,2个)

7. 漏斗(1个) 8. 试管夹(2个)

9. 纱布(15块) 10.离心机(1台)

[实验材料]

1. 鸡血细胞液(5ml~10ml) 2. 95%乙醇(预冷24h)

3. 蒸馏水 4. 柠檬酸钠(质量浓度0.1g/ml)

5. 氯化钠(2mol/L和0.015mol/L) 6. 二苯胺

7. 高氯酸 8.乙醛

9. 冰乙酸

[实验步骤]

实验前需要制备鸡血溶液,制备的方法是:取柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/ml的溶液(抗凝剂)100ml,置于500ml烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约180ml)注入烧杯中,同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免凝血。然后,将血液倒入离心管内,用1000rpm离心2min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液(如果没有离心机,可以将烧杯中的血液置于冰箱内,静置一天,使血细胞自行沉淀)。

1. 提取鸡血细胞的细胞核物质

将制备好的鸡血细胞液5ml~10ml,注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20ml,同时用玻璃棒充分搅拌5min,使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500ml的烧杯中,取其滤液。

2. 溶解细胞核内的DNA

将氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液40ml加入到滤液中,并摇动烧杯,使其混合均匀,这时DNA载溶液中呈溶解状态。

3. 析出含DNA的粘稠物

沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现,注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水,溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量的浓度相当于0.14mol/L)。

4. 滤取含DNA的粘稠物

用放有多层纱布的漏斗,过滤步骤3中的溶液至500ml的烧杯中,含DNA的粘稠物被留在纱布上。

5. 将DNA的粘稠物再溶解

取1个50ml烧杯,向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20ml。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中,用玻璃棒不停地搅拌,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。

6. 过滤含有DNA的氯化钠溶液

取1个100ml烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液,DNA溶于滤液中。

7. 提取含杂质较少的DNA

在上述滤过的溶液中,加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50ml(使用冷却的酒精,对DNA的凝集效果较佳),并用玻璃棒搅拌,溶液中会出现含有杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。注意观察丝状物是什么颜色。

8. DNA的鉴定

取两支20ml的试管,各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。

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