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细胞冷冻保存 (一)

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-7-15  点击次数:1803

1. 注意事项:

1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 – 90 %致密度。

1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。 1.4. 冷冻保存之细胞浓度:

1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml

1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。

1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。

1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。

1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 % DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。

1.6. 冷冻方法:

1.6.1. 传统方法: 4℃ 10 分钟---> -20℃ 30 分钟---> -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 长期储存。

1.6.2. 程序降温:利用等速降温机以–1 ~ -3℃/分钟之速度由室温降至–120℃,放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。

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