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寡核苷酸实验经典问题和回答

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-7-16  点击次数:1736

在不少生命科学重点实验中,我们都需用到寡核苷酸,因此,掌握寡核苷酸的技术对于整个实验非常重要。本文集合了各个论坛里的兄弟姐妹对寡核苷酸相关实验和概念的经典问题和回答,希望对大家的实验有所启发。

Q1、大家好,最近看文献,发现了反义寡核苷酸、义寡核苷酸、错义寡核苷酸(无意义寡核苷酸),我知道反义寡核苷酸技术,但是什么叫义寡核苷酸、错义寡核苷酸(无意义寡核苷酸),查了一下没有搞清楚,请各位老师帮忙解释一下啊,非常感谢!

A1、举个例子说明吧。

Stat3正义寡核苷酸序列:5’ AGAAACAGGATGGCCCAATGG 3’,即与原始DNA序列的正链;

Stat3反义寡核苷酸序列:5’ CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3’;即正链的反向互补序列;

Stat3错义寡核苷酸序列:5’ CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3’;即将反义链个别或若干个碱基随机改变,产生的新链,又叫scrambled strand.

Q2、在非变性的聚丙烯酰胺凝胶中,相同长度的双链和单链寡核苷酸迁移率那个快一些?有理论根据吗?我使用12%的非变性的聚丙烯酰胺凝胶检测单链寡核苷酸以及互补单链核苷酸退火后的双链寡核苷酸,发现双链明显较快。我该怎么说明一下这种现象?(探针用于EMSA)另外,双链寡核苷酸形成构象的机会大吗?有没有必须的最小长度?

有知道的高手请尽快指点!非常需要答案!

A2、我想知道你跑单链的时候怎么看到的颜色,如果能看到,也是单链的二级结构了?对于这个问题,似乎要取决于此寡核苷酸的序列,如果单链就能形成二级结构,而且稳定,理论上讲单链的应该跑得快。而没有二级结构,可以想象双链中插入的EB较多,跑得比无EB会慢些,但结构完整、封闭,也许会类似球形构象(相对比无二级结构的单链),跑得快些。不过这都不是书本上可查得到的理论依据。

Q3、请教各位高手,

我年前做了部分原位杂交,用RNA探针,图不漂亮。现在想用寡核苷酸探针做,有些问题请教各位!

1,寡核苷酸探针序列选择需要注意事项。有没有可以帮助设计探针的公司,大家觉得那家公司的探针合成和标记比较过关,烦您推荐给我。

2,看到的文献多是同时用三条探针进行杂交,也有用5条探针的,请教各位用几条比较好?

3,寡核苷酸探针最大的问题可能是非特异性的问题,请教各位怎样增加特异性,减少非特异的产生???

A3、我不知道你要的探针多长有什么特别要考虑的,若图简单,不若合成一段(含T7promoter识别序列),然后按照MAXIscript?T7 in vitro Transcription Kit.就可以做成RNA 探针了,应该没什么难得!(长片断的RNA探针我没有经验)

Q4、各位大侠,我问一个菜鸟问题,我要在一个寡核苷酸的5’末端标记上[gama-32P]ATP。分子克隆上说5‘末端要是带[-OH]羟基。我直接从公司合成的寡核苷酸,不作任何处理,结果没有标记上。我问一下,直接从公司合成的寡核苷酸5’末端是带什么基团,是不是直接带羟基[-OH]。谢谢!!另外利用T4寡核苷酸激酶使寡核苷酸5‘末端磷酸化制备放射性寡核苷酸探针需要有那些注意的事项,谢谢!!!

A4、如果不要求修饰,公司合成的OLIGO的5'端不会做任何修饰,可以直接用T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK)进行5'磷酸化,当然了磷酸化的效率受到很多因素影响。T4 PNK催化的核酸5'末端标记反应的效率受5'末端形状的较强影响。一般效率按:单链末端≥双链5'突出末端>双链平滑末端>双链3'突出末端的顺序降低。特别是由于双链的缺口 (Gap) 及切口 (Nick) 部分的磷酸化非常困难,所以为了提高标记效率需要使用高浓度、过量的ATP。另外,即使同为平滑末端,富含AT的末端标记效率较高。

Q5、我想用脂质体转染反义寡核苷酸,看相关文献,其脂质体的使用量和反义寡核苷酸的浓度设计区别很大,我想请教下,我用96孔板做,脂质体的量以什么为宜啊,我转染入的是癌细胞。或者说脂质体与反义寡核苷酸的量以什么比例最好啊

A5、一般建议用无血清培养基稀释,用量比是根据转染试剂的Protocol来,具体可以进行换算

Q6、哪位大侠做过寡核苷酸探针的杂交?杂交温度如何确定?寡核苷酸片断大约18-20bp,谢谢请多指教

如果跟据Tm-5度来确定,是不是指的水溶液杂交?加了50%的甲酰氨又该如何估算?

有没有必要做个dot blot来精确杂交温度?

A6、我觉得因改是4×(A+T)+2×(G+C),再减去5度就行。寡核苷酸探针的杂交温度不应该遵循PCR产物探针的原则。

Q7、链寡核苷酸,全段时间跑出过带,后来就又没有带了,不知道怎么回事。还有人跑过化学合成的miRNA么,想检测下看看我的东西,怎么总是一点带都没有,不知道这种20个核苷酸的单链miRNA能不能用EB染色,还是量不够?急,请大家帮忙

A7、你可以尝试一下用5 uL样品在浓度为15%的PAGE(含7 M 尿素)上电泳(用1XTEB 缓冲液) ,最后用0.5ug/mL 的EB 溶液染色。我们这边不用EB染色,但是EB的灵敏度还是很高的,如果EB不行,其他的也都够呛

Q8、PCR寡核苷酸样品被溴酚蓝混合了,如何分离?

A8、跑个电泳切后回收一下试试

最后再讲一下,寡核苷酸在引物设计实验中也有着不可忽视的作用,使用合适的寡核苷酸可从三方面考虑:1)估测即将出现的核酸双链稳定性;2)遵从引物选择通用准则;3)根据氨基酸序列design寡核苷酸。

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