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质粒DNA限制性酶切与琼脂糖凝胶电泳分离验证实验操作步骤

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-7-16  点击次数:1732

一、 DNA酶切反应

 

1. 用微量移液枪向灭菌的eppendorf管分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μL, 再加入去离子水使总体积为19μL, 将管内溶液混匀后加入1μL酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下, 使溶液集中在管底。

 

2. 混匀反应体系后, 将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温2-3小时, 使酶切反应完全。

 

3. 每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀, 以停止反应, 置于冰箱中保存备用。

 

二、DNA分子量标准的制备

 

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子, 其商品溶液浓度为0.5mg/mL, 酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段, 长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段, 长度分别为21.2,7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

 

三、琼脂糖凝胶的制备

 

1. 取10×TBE缓冲液20mL加水至200mL, 配制成1×TBE稀释缓冲液, 待用。

 

2. 胶液的制备:称取0.4g琼脂糖, 置于200ml锥形瓶中, 加入50mL 0.5×TBE稀释缓冲液, 放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化, 取出摇匀, 此为0.8%琼脂糖凝胶液。

 

3. 胶板的制备:将有机玻璃胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液其终浓度为0.5μg /mL(也可不把EB加入凝胶中, 而是电泳后再用0.5μg/mL的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封有机玻璃胶槽两端内侧, 待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低, 否则凝固不均匀, 速度也不可太快, 否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子, 注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

 

4. 加样:取10μL酶解液与2μL 6×加样缓冲液混匀, 用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低, 则可依上述比例增加上样量, 但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头, 以防止互相污染, 注意上样时要小心操作, 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

 

5. 电泳:加完样后, 接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带动到距凝胶前沿约2cm时, 停止电泳。

 

6. 染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中, 室温下染色20-25分钟。

 

7、观察和拍照:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。

 

注意事项

 

(1) 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大,否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

 

(2) 酶活力通常用酶单位(U)表示,酶单位的定义是:在最适反应条件下,1小时完全降解1μg λDNA的酶量为一个单位,但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解,需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的,除考虑成本外,酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

 

(3) 市场销售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释。另外,酶通常保存在50%的甘油中,实验中,应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下,否则,酶活性将受影响。

 

(4) 观察DNA离不开紫外透射仪, 可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时, 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm), 以减少紫外光切割DNA。

 

(5) EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

 

(6) 当EB太多, 胶染色过深, DNA带看不清时, 可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。

 

本文总结了质粒DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳的原理;DNA酶切反应和琼脂糖凝胶的制备过琼等琼脂糖电泳操作步骤,需要注意的是EB是致癌物质,应避免自己免受EB的伤害。

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