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定量蛋白质组学之SILAC技术

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-7-17  点击次数:1835

作为蛋白质组学研究中一种强有力的工具,质谱在过去很长一段时间内只是用于定性研究,鉴定蛋白质和翻译后修饰。于是,科学家们不断开发出定量蛋白质组学方法,来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。 

 

    

   早期的蛋白质研究致力于鉴定并了解单个蛋白或蛋白复合物的功能,这些年,仪器和技术的进步大大促进了蛋白质组学研究。十年前,我们或许只能分析数百个蛋白,而如今,我们能分析数千个。在这个分析水平,我们可研究细胞、组织或生物体的整体蛋白动力学。这种蛋白质组的研究,与当今热门的基因组、转录组和代谢组等领域的研究一起,让我们更好地了解了整体的生物过程,以及它们如何应对不同刺激,或在疾病状态下如何改变。


    若想了解一个人患病之后,基因表达水平发生了怎样的改变,DNA芯片是一个最常见的选择。然而DNA芯片也许并没有说出全部,因为基因表达的差异并不一定直接对应着蛋白表达的差异。为了更准确地比较两个样本的蛋白水平,科学家们通常使用双向电泳外加质谱,然而流程复杂,通量低,重复性也欠佳。


    作为蛋白质组学研究中一种强有力的工具,质谱在过去很长一段时间内只是用于定性研究,鉴定蛋白质和翻译后修饰。为什么不能定量?因为各次运行之间,水解后的肽段在理化性质上表现出很大差异,从而导致质谱响应的变化。此外,质谱只能对样品中的一部分肽段进行分析。于是,科学家们不断开发出定量蛋白质组学方法,来了解细胞、组织或生物体的整体蛋白质动力学。


    定量蛋白质组学又分为相对定量和绝对定量。相对定量方法(如SILAC、ICAT、ICPL等)是用来比较样品之间的蛋白或肽段丰度;而在未标记的样品中加标有已知浓度的同位素标记的合成肽段,就实现了目标肽段的绝对定量。


    显然,绝对定量比相对定量更为理想,因为不同样品的肽段绝对值也可用于比较相对蛋白变化。然而,相对定量却更为常用,因为每个目的蛋白的绝对定量都需要昂贵的试剂,也需要花费大量的时间来开发分析。在相对定量方法中,SILAC又是比较常用的一种。


SILAC技术的原理


         10年前,SILAC诞生于南丹麦大学。它的发明者是Matthias Mann教授。2005年,这位牛人教授来到了德国慕尼黑的马普生物化学研究所。SILAC的全名为stable-isotope labelling by amino acids in cell culture。它的原理很简单:两组细胞同时培养,A组是在包含正常氨基酸(light)的培养基中;B组的培养基则含有“重型(heavy)”的氨基酸,即稳定同位素标记的氨基酸。最初SILAC 使用的标记氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸,目前常用的标记氨基酸有亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。细胞传代若干代后,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到蛋白中,取代了原有的氨基酸。这样,两个蛋白之间就存在分子量的改变,而其它化学性质无异。


    然后将两组细胞混合,提取出蛋白质组,并交给质谱去测定。每个肽段作为质谱中的一对——低分子量的肽段含有轻型氨基酸,来源于A组,高分子量的肽段则含有重型氨基酸,来源于B组。如果SILAC肽段对呈现1:1的比例,则蛋白质组中此蛋白的丰度无差异。如果含有重型氨基酸的肽段峰强度偏高,则说明B组中蛋白丰度更高。因为稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸的化学性质基本相同,除了分子量差异,则质谱上峰强度的比值直接对应了A组与B组的比例。虽然整个实验的时间主要取决于细胞生长的速率和所采用的各种样品处理步骤,但一般来说,SILAC实验从开始到结束,包括数据分析,大约需要20到25天。

 

         SILAC方法有很多优势。细胞在传代6-8代之后,蛋白标记效率可达90%以上。标记是在样品处理前引入,随后进行蛋白质分离、酶切和鉴定,后续实验对样品的影响一致,故样品处理所带来的定量误差(bias)会很低。在检测极低水平的蛋白变化或翻译后修饰时,这一点特别有用。此外,SILAC灵敏度高,样本量要求少,通常每个样品只需要几十微克的蛋白量。


     当然,这种方法也有限制。一些细胞会将高浓度的精氨酸转化成脯氨酸,这样在精氨酸标记的情况下会产生两个不同的重型峰,代表了精氨酸或脯氨酸标记的肽段。研究人员也开发出一些方法,来避免这种转化。对于那些很难培养,或对培养基成分变化极其敏感的细胞系而言,这种代谢标记的方法也不大奏效。此外,这种技术也有可能影响生物体发挥功能,因为培养条件已改变。     

 

经典的SILAC实验


       2007年,Matthias Mann教授在《Nature Protocols》上发表了经典SILAC实验的流程。1 2-3个样品被分别标记,并在质谱分析中直接比较。来自不同样品的等量细胞或细胞裂解液混合,并在后续步骤中作为单个样品来处理。这样可使用任一种蛋白或肽段富集方法,也不会担心在最后的定量分析中引入定量误差。


    经典的SILAC实验(也就是double-SILAC)比较2个或3个样品,但是通过两个triple-SILAC实验,也可以比较5个样品,注意,这两个实验至少有一个共同样品。这在时间进程实验中比较常用。在double-SILAC中,MaxQuant(马普开发的软件包)确定“重型”和“轻型”的肽段比例,而在triple-SILAC中,它确定“重型”与“中等”、“中等”与“轻型”以及“重型”与“轻型”的比例。


动物体的SILAC实验


        2008年,Mann的小组及其他小组的研究表明,SILAC也能用于整个小鼠的同位素标记。2 Mann小组通过给小鼠提供含有13C6赖氨酸的饲料,将SILAC方法拓展应用于体内研究。通过对小鼠饮食、生长发育、生育能力、活动和生理情况的观测,发现SILAC标记对小鼠后几代都无不利影响。在F2代小鼠体内,他们观察到13C6赖氨酸几乎标记了体内所有器官的蛋白质,使得对这一代和以后若干代小鼠进行定量的蛋白质分析成为可能。


          Krüger等人采用了三种基因表达缺陷的小鼠模型对上述方法进行了验证。在每个实验中,差异标记野生型小鼠和基因表达缺陷的小鼠,然后通过质谱检测明确证实了相关组织中相应蛋白质的表达缺失。他们的研究结果表明,体内SILAC标记方法是一种多功能工具,能定量比较缺陷小鼠的蛋白质组,从而确定体内复杂环境中的蛋白功能。


     而线虫的定量蛋白质组分析也开展得如火如荼。去年,两个小组都采用氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)方法,开展了线虫的定量蛋白质组实验,文章发表在同一期的《Nature Methods》上。


     英国邓迪大学的Mark Larance等改良了SILAC方法,用一种重型赖氨酸和重型精氨酸标记的大肠杆菌喂养线虫3。质谱分析表明F1后代中已掺入重型精氨酸和赖氨酸。同时,他们还采用RNAi via feeding策略,靶定了精氨酸-脯氨酸转化过程中必需的鸟氨酸转氨酶基因orn-1。质谱结果表明,这种策略几乎完全避免了精氨酸-脯氨酸的转化。将此方法与定量蛋白质组方法相结合,研究人员还鉴定了线虫的热击反应。


     作者认为,他们的SILAC方法为线虫的定量蛋白质组研究带来了很多机会。没有了精氨酸-脯氨酸的转化,SILAC实验可更高效地开展。SILAC技术还能协助确定线虫发育、衰老以及压力过程中的整体蛋白质组变化。


     几乎同时,南丹麦大学生物化学与分子生物学系的Julius Fredens等也使用了非常相似的方法。4 他们用重型同位素标记的大肠杆菌喂养线虫,得到了重型同位素赖氨酸标记的线虫。利用标记的线虫和定量蛋白质组方法,他们鉴定出一些蛋白,响应了线虫核激素受体49(NHR-49)的功能丧失。作者认为,定量蛋白质组学与选择性基因敲除的结合使用,是研究线虫的一种强有力工具。

 

Super-SILAC


    因组织样品的复杂度以及代谢标记在非增殖细胞上的限制,组织蛋白质组学面临了很大挑战。之前,研究人员使用SILAC标记的细胞作为“spike-in”对照,解决了标记问题,因为通过与对照比较,可进行每种组织样品的定量。日本科学家曾将标记的Neuro2A细胞裂解液加入小鼠的脑组织裂解液中,开展小鼠脑组织的定量蛋白质组研究。


    然而,考虑到组织的复杂度,以单个细胞系来代表组织似乎是不够的。此外,若样品是多样性的,如肿瘤样品,则单个细胞系也无法代表这种多样性。为了克服这些挑战,Matthias Mann教授及其同事将多个SILAC标记的细胞系混合在一起,作为“spike-in”对照,这就是Super-SILAC(超级SILAC)。1


     他们将多个过去建立的癌症细胞系中的标记蛋白裂解液混合,这样就复杂度而言,它们比单个细胞系更为全面,从而增加了准确性。为了代表更宽范围的特定肿瘤类型,他们选择了不同来源、不同阶段,且携带各种分子标记物的细胞系,并将等量的标记蛋白混合成超级SILAC混合物(super-SILAC mix)。随后将这些标记蛋白裂解液以1:1的比例与每种组织样品混合,裂解液充当了组织比较的内部标准。


    在乳腺癌组织的研究中,Mann及其同事通过标记四种乳腺癌细胞系,外加一种正常的乳腺上皮细胞类型,以1:1:1:1:1的比例将蛋白裂解液混合,获得了完整的SILAC-标记蛋白。他们比较了小叶和导管乳腺肿瘤中与转变过程、化疗敏感性和药物抗性相关的低丰度蛋白。


     这种新方法有潜力将相对蛋白质组定量方法扩展到肿瘤生物学研究的分子方面,并可能成为探索候选生物标记物的工具。SILAC与其他相对定量的质谱技术相比,优势在于灵敏度高、定量准确,且实验误差很小,因为样品在实验流程的早期就已混合。此外,超级SILAC方法还有可能成为了解癌症分子机制的宝贵工具。


开展SILAC研究的工具


    赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)在收购HyClone和Pierce之后,在SILAC方面的产品线还是相当丰富的。除了经典的SILAC培养基(RPMI-1640和DMEM)外,赛默飞世尔近年来也推出了不少新产品。


SILAC培养基 & 血清


   所有的SILAC培养基都不含有L-赖氨酸和L-精氨酸。对于经典的RPMI-1640和DMEM,赛默飞世尔提供了液体(500mL)和粉剂(可配成10L)的包装。除此之外,它还有专门用于SILAC的MEM、DMEM:F12、F12、IMDM、McCoy’s 5A等培养基。当然,这些还不够。为了满足干细胞研究的需求,它还推出了用于SILAC的小鼠干细胞扩增DMEM,低渗透压小鼠干细胞DMEM。而无酚红MEM培养基适用于易受雌激素刺激的细胞,如乳腺癌细胞系MCF7,而不会产生人为的雌激素反应。此外,赛默飞世尔还提供透析过的FBS、干细胞专用的透析FBS以及血清替代物。


重型 & 轻型氨基酸


    赛默飞世尔还单独提供了同位素标记的氨基酸,可与上面提到的缺陷型培养基共同使用。重型和轻型L-赖氨酸和L-精氨酸是SILAC分析中最常用的氨基酸。利用氨基酸的不同同位素,可轻松分析三种不同的实验条件。以赖氨酸为例,4,4,5,5-D4 L-赖氨酸和13C6 15N4标记的L-赖氨酸与轻型赖氨酸相比分别有4-和8-Da的分子量变化。而13C6 L-精氨酸和13C6 15N4 L-精氨酸则分别比轻型精氨酸的分子量高了6-和10-Da。L-亮氨酸也是SILAC中很常用的氨基酸。此外,赛默飞世尔还提供了L-脯氨酸作为培养基添加剂,以防止同位素标记的精氨酸代谢转换成脯氨酸。


SILAC实验流程


    据赛默飞世尔介绍,SILAC流程如下:利用含有0.1毫克/毫升的重13C6 L-赖氨酸-2HCl或轻L-赖氨酸-HCl,并且在含有10%透析过的FBS的SILAC DMEM培养基上培养A549细胞,培养六代(10天)。在完全标记后,利用5 μM喜树碱处理13C6 L-赖氨酸标记的细胞24小时。利用Thermo Scientific M-PER哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂裂解来自每种样品(轻和重)的细胞。将样品按照使用Thermo Scientific BCA蛋白定量试剂测定的蛋白浓度进行标准化,然后从每种样品中取50毫克并混匀,此后利用4-20%的SDS-PAGE分析样品。利用Thermo Scientific GelCode蓝色染色试剂对凝胶进行染色,再利用Thermo Scientific 胶内胰酶消化试剂盒对蛋白进行消化和烷基化,最后利用LTQ Orbitrap杂交质谱进行分析

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