新闻中心
 联系我们
蓝盖瓶
  联系人:陈先生
  在线QQ:点击这里给我发消息
  在线旺旺:点击这里给我发消息
  手机:15371846806
  电话:05503536088
  传真:05503536088
  E-mail:wenoote@163.com
  网址:http://www.buliaoping.com
  地址:安徽省滁州市九江东路283号1号厂房
补料瓶
补料瓶
 新闻中心

轻松捕获microRNA的靶标

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-8-18  点击次数:1600

为了更好地了解miRNA影响健康和疾病的机制,我们首先需要知道miRNA会对哪些基因起作用。然而,这并非易事。每个miRNA都能够调控数以百计的靶基因。之前的miRNA靶标预测主要是通过一些算法来实现,而Clontech公司(Takara旗下)近日推出一种新工具,能协助鉴定细胞中的miRNA靶标。

        microRNA(miRNA)分子虽小,却在基因表达的调控上发挥着重要作用。为了更好地了解miRNA影响健康和疾病的机制,我们首先需要知道miRNA会对哪些基因起作用。然而,这并非易事。每个miRNA都能够调控数以百计的靶基因。之前的miRNA靶标预测主要是通过一些算法来实现,而Clontech公司(Takara旗下)近日推出一种新工具,能协助鉴定细胞中的miRNA靶标。

        这一工具名为MirTrap系统。它利用RISC蛋白的显性失活突变体,允许miRNA与其靶标结合,但限制进一步的加工。此亚基整合到内源的Argonaute/RISC复合物中,并“锁定”miRNA-靶标mRNA。显性失活亚基上的DYKDDDDK(FLAG表位)标签允许整个Ago/RISC复合物的捕获和分离。这样就能实现miRNA及其靶标的免疫沉淀,从而通过新一代测序或定量PCR来鉴定或定量。

   整个过程大致如下:

1. 创建miRNA模拟物。
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞,并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物(其中包括靶标mRNA)进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA,鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
 
MirTrap系统中包含了pMirTrap载体、免疫沉淀及后续分离所需的试剂、Xfect microRNA转染试剂以及对照试剂,足够15次分析使用。
 
Xfect microRNA转染试剂也是Clontech最新推出的产品。它形成可生物降解的纳米颗粒,从而实现miRNA的高效转染。此试剂盒提供两种转染聚合物:Xfect MicroRNA Transfection Polymer,这是为小RNA的转染而优化的;Xfect Polymer,这是为质粒DNA而优化的。
 
在miRNA转染时,只需要Xfect MicroRNA Transfection Polymer;而在miRNA与质粒DNA的共转染时,须在转染反应中加入少量的Xfect Polymer。转染过程可在血清存在时开展。

上一篇:单细胞DNA测序揭示微生物“暗物质”
下一篇: 利用HyQSphere微载体的取样技术