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淋巴细胞的分离和激化实验

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-8-29  点击次数:1622

实验试剂

1. PBS(Dulbecco):
0.10g/L 无水CaCl2
0.20g/L KCl
0.20g/L KHPO4
0.10g/L MgCl2.6H2O
8.00g/L NaCl
2.16g/L NaH2PO4.7H2O
调pH至7.4

2. 生长培养基:
不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基10% FBS
庆大霉素(可不用)(10μg/ml)
2mmol/L L-谷氨酰胺
1mmol/L 丙酮酸钠

3. 促细胞分裂剂(终浓度)
5μg/ml PHA:1mg/ml母液-20℃分装冻存
25μg/ml 刀豆凝集素A(conA):0.4mg/ml母液-20℃分装冻存
商陆促分裂原:再水华母液-20℃分装冻存

 

实验步骤

1. 收集10ml全血,加入不含防腐剂的肝素(0.2ml肝素/10ml全血)。实验全过程保持无菌操作。
2. 在15ml离心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖,室温放置20~30min,沉降红细胞。沉降时间不宜过长,否则单核细胞将不再保留在富含白细胞的血浆。
3. 从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层的富含白细胞的血浆。
4. 富含白细胞的血浆室温300g离心8min,沉淀细胞。
5. 弃上清,细胞轻悬于1ml PBS中。
6. 于室温下,用无菌巴斯德吸管小心将细胞悬液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技术熟练,才能保持血浆曾在Ficoll-Hypaque层之间界面清晰。
7. 400g低温(4℃)离心30min,沉淀细胞。离心后切记不要破坏管中的分层。
8. 淋巴细胞在血浆和Ficoll-Hypaque层之间的白色浑浊条带中,小心取出贮存,弃红细胞沉淀。
9. 5mlPBS洗一次细胞,室温250g离心5min,沉淀细胞悬于3~5ml生长培养基中。
10. 全部细胞悬液转移至T25组织培养瓶,加促细胞分裂剂。

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