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动物细胞/组织培养常见的一些问题

发布作者:拂晓玻璃容器  发布日期:2013-10-14  点击次数:1598

由于影响因素过多,细胞/组织培养中出现的一些问题往往很难分析并得到解决,因此被人戏称为“黑色艺术”或“巫术”。本文列举了一些动物细胞/组织培养中常见的问题及解决方法。

1.培养试剂的保存:
血清:-5oC - -20oC 保存,避免反复冻融。
培养基: 2oC – 8oC避光保存。
完全培养基: 2oC – 8oC避光保存,并在2周内用完。
尽量缩短血清和培养基见光的时间。
2.液体培养基中谷氨酰胺使用方法:
很多细胞生长要求在培养液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20◦C冰冻保存,用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4◦C 冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。另一种选择是使用L-谷氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex配方中含有的成分之一) 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex与L-谷氨酰胺相比更加稳定,降解比较慢,提高细胞的存活和生长,极大降低对细胞有毒性的氨的积累。
3.培养基中是否应加酚红:
酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂,中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,特别是雌激素。为避免固醇类反应,培养细胞尤其是哺乳类细胞时,应使用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加酚红的培养基。


4.使用血清应注意的问题:
1)血清第一次使用前,是否应在56oC,30分钟加热血清以灭活补体系统?
激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。实验显示,经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞生长只有微小的促进或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染。而把血清放在37℃环境中又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量。
2)通常使用的血清的种类:
新生牛血清:新出生牛5天内取血制成。小牛血清:小牛出生16周以内采血制成。胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。国内厂家往往不能做到,经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:(1)特级胎牛血清:40纳米过滤,内毒素含量≤10EU, 血红蛋白含量≤10mg/dl。(2)优等胎牛血清:经过3次100纳米过滤,内毒素含量≤25EU/ml,血红蛋白含量≤25mg/ml。(3)标准胎牛血清:3次100纳米过滤,低内毒素,低血红蛋白含量。
3)为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白,如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。建议在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。
4)血清解冻后发现有絮状沉淀物出现:
血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成。而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存在于血清中,也是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。
5)如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作: (1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-2℃至4℃过夜,37oC水浴解冻)。若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时要随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。(4)如果在高于40oC的水浴中融化并且不时常摇晃混匀,非常容易造成沉淀物增多。同样血清的热灭活也造成沉淀增多,若非必要,可以省去热灭活。(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。
5.培养用液pH对细胞生长的影响:
由于,大多数细胞培养适宜的pH为7.2-7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受力差,无限细胞系耐受力强。但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。因此,我们在配制培养用液时,可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时,溶液的pH还会向上浮动0.2左右。
6.培养基pH变化迅速:
培养箱中CO2浓度不正确。碳酸氢钠在培养液中浓度范围为2.0 – 3.7g/L时,CO2的浓度范围应分别为5% - 10%。
7.使用培养基时应注意的问题:
培养基在使用前需37oC预热。 细胞培养过程中,吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培养基焦化,将有害物质带入培养液中。尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间,减少污染机会。避免液体间、细胞间的交叉污染。配制完全培养基时,配制的量最好在2周内用完为好。
8.细胞传代消化时胰蛋白酶的使用问题:
培养细胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg+离子和血清等因素有关。通常情况下,pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力最强。另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。每次进行传代消化前,一定要用无钙镁离子的PBS液或D-Hanks液反复冲洗细胞培养瓶,以便将含血清的培养基冲洗干净,这样可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为: (1)0.05%胰蛋白酶-EDTA; (2)0.25%胰蛋白酶-EDTA。多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA这种消化液。

第一次开瓶后应立即少量分装于无菌管中,保存于–20℃,避免反复冻融造成胰蛋白酶活性降低,并可减少污染的机会。

注意:如果选用无血清培养基(如启维益成公司代理的TNC Bio公司生产的产品 - 完全无动物成分的血清替代品XerumFreeTM与其他培养基混合配制的无血清培养基),在细胞传代时,不可使用胰蛋白酶消化,因为胰蛋白酶在无血清时可去除细胞膜表面的受体,这种情况应使用AccutaseTM消化。
9.贴壁细胞在用蛋白酶消化时不易分离:
1)培养液中存在酶的抑制剂,可使用无钙镁离子的37oC预热的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍,再消化
2)胰酶浓度太低,使用更高浓度的胰酶,更高浓度的EDTA或不同的酶消化,37oC消化以提高酶活性
3)细胞处于铺满状态时间太长,形成细胞间的紧密连接,以后注意在细胞铺满之前进行继代培养。
10.细胞分离后形成团块:
1) 细胞分散过程太过分,如用力吹吸、酶浓度过高、消化时间过长或温度过高,酶溶液有毒性(如缓冲液pH或渗透压不正确等)以至基因组DNA从破裂的细胞中释放出来。解决方法是在细胞悬液中加入1滴无菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。
2)去除上清时,细胞离心的强度太大或时间太长,应使用125g, 10分钟轻微离心。
11.悬浮细胞形成团块:
1)培养液中含有钙镁离子
2)支原体污染
3)由于过度消化造成细胞裂解,释放出基因组DNA
12.细胞不贴壁:
1)消化时间过长,细胞膜上的贴壁蛋白被去除了
2)培养基中的血清或贴壁因子(常见于无血清培养基)不足,可在培养基中加入贴壁因子或使用胶原蛋白、多聚L赖氨酸、纤连蛋白等包被的培养瓶。
3)支原体污染
13.离心动物细胞的离心速率:
回收动物细胞,离心速率一般为300g,5 - 10 分钟,离心强度过大将造成细胞破裂死亡。
14.细胞生长缓慢:
1)换用了不同的培养基或血清,解决方法是可比较不同培养基成分,用生长实验比较以前批次和新批次的血清, 提高接种细胞数,使细胞逐步适应新的培养基 。
2)L-谷氨酸等促进细胞生长的成分没加入,用尽或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide(如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex)替代L-谷氨酸
3)支原体污染或低水平细菌或真菌污染
4)培养试剂保存不当
5)接种细胞数太少
6)细胞传代次数太多
7)细胞传代时密度太高,应在细胞铺满前的指数生长期传代
15.细胞死亡:
1)培养箱中无CO2,检查管子有无泄漏,是否需更换CO2罐,尽量减少开关培养箱的次数
2)培养箱温度不恒定
3)抗真菌剂或抗生素浓度过高,对细胞产生毒性
4)细胞在冻存或解冻过程中被破坏
5)培养基中渗透压不正确
6)培养基中积累了有毒的代谢产物
16.细胞冷冻培养基的成份:
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,所以不可将DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。
17.DMSO的等级及使用和保存:
冷冻保存使用之DMSO 等级必须为Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C。避免反复冻融造成DMSO 裂解而释出有害物质,并可减少污染的机会。若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。
18.冻存液中的甘油的保存:
要避光保存,见光后甘油转化为对细胞有毒性的丙烯醛。
19.细胞欲冷冻保存时注意事项:
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml为宜。实际操作时,建议按照细胞生产商建议的细胞密度冻存。冻存传代次数低的细胞。
20.冷冻保存细胞之方法:
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30-60 分钟→ (-20℃ 30 分钟)→ -80℃16-18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存,如细胞浸在液氮中,有可能被液氮中的微生物污染。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20℃不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡。也可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中,但存活率降低。
21.细胞解冻:
快速解冻,将37oC预热的培养基逐滴加入解冻的细胞。
22.支原体污染、检测及处理:
支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,最小直径0.2um,可通过滤器。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行实验研究时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。支原体污染后,培养基可不发生浑浊,细胞病变轻微或不明显,因此难以发现。
目前,支原体检测的方法有以下几种。(a)相差显微镜观察;(b)低张处理地衣红染色法; (c)荧光染色法;(d)酶标法; (e)PCR法:这是常用的一种简便的检测方法。 此方法灵敏度高,检测耗时短,样品量小(只需50ul细胞培养用液上清),但引物及制剂费用较高。
支原体污染的处理:1)丢弃细胞,培养基及其他培养用试剂 2)重新获取未污染细胞,新鲜培养基和试剂。

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